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      雜交捕獲的五大流程分別是怎樣的

      發布時間:2022-04-24      點擊次數:67
         雜交捕獲的原理是人工設計探針,探針可以和目標區段部分或者全部互補。將樣本和探針混合,探針會將目標區段捕獲,未設計探針的區段會被洗脫丟棄,之后通過變性(一般是調節PH值到堿性)將探針和捕獲區段分開,被捕獲的片段即可進行二代測序文庫構建。
        雜交捕獲的優缺點分別是怎樣的:
        優點:捕獲區段大,可以達到幾百MB,遠超PCR方案和MIP方案,同時根據探針的原理其均一性很好,均一性是評價捕獲技術很關鍵的參數,均一性好后續測序成本就會下降。
        缺點:容易捕獲非目標片段,造成成本增加。因為雜交前樣本會被隨機打斷一般認為500bp是比較合適的長度,探針捕獲時可能和目標片段部分雜交,導致一些含有部分目標區段的片段被捕獲。所以捕獲的特異性較差,容易捕獲非目標區段。
        雜交捕獲的流程如下:
        1、文庫制備
        將提取后的基因組DNA利用超聲或酶切的方法將基因組DNA進行片段化,并進行末端修復和接頭連接,接著進行PCR及純化。
        2、雜交反應
        將帶有生物素標記的RNA/DNA探針,對DNA文庫的目標區域片段進行結合(探針應過量)。
        3、鏈霉親和素磁珠結合
        使用鏈霉親和素磁珠結合帶有生物素標記的RNA/DNA探針與DNA文庫相結合的雙鏈復合物。
        4、清洗
        利用不同鹽濃度的緩沖液進行多次清洗,主要目的為去除未被探針捕獲的非特異性雜交,保留目標區域的DNA從而達到捕獲效率的提升。
        5、捕獲后擴增
        對捕獲及清洗后的DNA產物進行PCR擴增,構建完成靶向富集的測序文庫。
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